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ELISA常见样本处理及保存

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发表于 2023-3-21 07:44:40 | 显示全部楼层 |阅读模式
用于ELISA实验的样本有多种类型,包括血清和血浆、细胞培养上清、尿液以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法存在差异。合适的样本预处理,是确保ELISA实验准确性的第一步。这里,小E介绍几种不同样本类型的处理方法:
常规样本处理方式

血液样本
血液样本分为全血、血浆、血清三种。简单描述:
全血:全血=血浆+血细胞。
血浆:全血加抗凝剂后离心分离出来的淡黄色液体是血浆。
血清:全血不加抗凝剂而自然凝固后分离出来的,不含纤维蛋白原的淡黄色液体是血清。
血液样本是ELISA/液相实验最常用的样本。在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质,将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确,出现假阳性结果。另外,样本还需要避免细菌污染,因为其可能会导致样本含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。且要避免使用高血脂样本。脂质会影响抗原抗体的结合,从而影响测值的准确性。
1.血清和血浆

血清是ELISA实验最常用的样本,其预处理也十分简单。

  • ① 使用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液样本,将试管或离心管在室温下放置1小时或2-8℃过夜,分离出血清;
  • ② 2-8℃条件下,以1000×g离心20分钟,小心收集上层血清。
血浆样本

  • ① 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,2-8℃条件下,以1000×g离心15分钟,小心收集上层血浆;
  • ② 常见的抗凝剂包括:EDTA钠盐,肝素钠,枸橼酸钠等。
2.细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中,在2-8℃条件下,以1000×g离心20分钟,除去细胞碎片和杂质,收集上清液。
3.细胞裂解液


  • ① 吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,再加入适量的培养基,将培养板上的细胞冲洗干净(悬浮细胞可以省略该步骤);
  • ② 将细胞悬浮液收集到离心管中,在2-8℃条件下,以1000×g离心5分钟,再吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次;
  • ③ 加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂),重悬细胞。添加比例:约1×106个细胞加入150-250μL PBS重悬细胞;
  • ④ 使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复冻融过程数次,直至细胞完全裂解。也可使用超声波细胞破碎器,超声处理悬浮液来裂解细胞;
  • ⑤ 2-8℃条件下,以1500×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液。
4.组织匀浆


  • ① 用预冷的PBS(0.01M,PH7.4)冲洗组织,除去表面残留的血液或杂质;
  • ② 将组织块称重,再切成尽可能小的碎块,以便充分匀浆;
  • ③ 加入适量的预冷PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g组织样品对应9mL PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂),用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融;
  • ④ 将匀浆液吸入离心管中,2-8℃条件下,以5000×g离心5分钟,收集上清液。
5.脑脊液


  • 根据实验要求,取适量上清液进行实验测定。
  • 大鼠脑脊液采集方法:采集脑脊液时,用湿纱布擦试大鼠颈背部皮肤,剪去背毛暴露皮肤。两耳连线剪一横切口(1.5cm 左右),在其中点向尾侧沿皮下剪开 2cm,将皮分离两侧,扩大视野。紧贴大鼠头 骨依次逐层剪切各肌层,并断端依次拉向尾侧扩大视野。注意,有出血时用干纱 布按压止血,保持术口清晰。接近颈后黄韧带时,小心地用 7 号注射针头分离覆 盖的肌肉,暴露寰枕膜。用 1ml 注射器(针头用止血钳使针尖与针体成 150 度钝 角),针斜面向上,针尖端近水平刺入蛛网膜下腔,固定针体,缓慢抽取脑脊液, 一般采集量为 100-200 微升。
6.肺泡灌洗液


  • ① 10%水合氯醛溶液,麻醉腹腔。打开腹腔,另取10mL注射器进行下腔静脉采血,尽可能将血放尽。
  • ② 在冰面上对肺进行肺灌洗。取37℃生理盐水5mL,分三次灌洗:2mL、1.5mL、1.5mL灌洗,回收率在70%以上。
  • ③ 使用无菌管收集肺泡灌洗液后1000xg离心10min,离心后收集上清,并将标本保存于-20℃或-80℃,且应避免反复冻融,如有沉淀形成,应再次离心。
样本保存方法

样品收集后,若在1周内进行检测,可保存于2-8℃的环境中;若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测)或-80℃(3个月内检测)的环境中,避免反复冻融。实验前,建议再次离心,去除沉淀物。
注意事项


  • 试剂盒的检测范围不等同于样本的浓度范围。如果样品中检测物浓度高于标准品的最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议查阅文献,并做预实验)。
  • 收集组织与细胞提取液样本时,不建议使用商品化的裂解试剂。裂解试剂中的成分,可能会影响抗原抗体结合,或造成基质干扰,最终影响实验结果。
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发表于 2023-3-21 08:35:43 | 显示全部楼层
支持你哈...................................
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发表于 2023-3-28 16:44:46 | 显示全部楼层
大人,此事必有蹊跷!
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发表于 2023-4-30 06:04:30 | 显示全部楼层
LZ敢整点更有创意的不?兄弟们等着围观捏~
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发表于 2023-5-1 22:24:53 | 显示全部楼层
LZ帖子不给力,勉强给回复下吧
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发表于 2023-5-14 16:25:14 | 显示全部楼层
报告!别开枪,我就是路过来看看的。。。
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发表于 2023-5-15 19:28:41 | 显示全部楼层
纯粹路过,没任何兴趣,仅仅是看在老用户份上回复一下
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发表于 2023-5-25 16:49:55 | 显示全部楼层
锄禾日当午,发帖真辛苦。谁知坛中餐,帖帖皆辛苦!
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