时序RNA-seq分析发现MAPK10是糖尿病诱发小鼠房颤的 ...

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简介：
房颤(AF)是2型糖尿病(T2DM)的主要并发症，在心房重构的发病机制中起着重要作用。然而，关于高血糖诱发房颤发生过程中心房中差异表达基因的研究鲜有报道。近年来，RNA测序（RNA-seq）分析已被应用于研究各种组织中基因表达谱的改变，已经确定了一些与遗传性心血管疾病相关的关键基因。
本研究旨在通过时间序列RNA-seq分析db/db小鼠T2DM模型心房的基因表达谱，验证中枢基因的作用。鉴定了db/db小鼠心房组织中差异表达的许多基因，这些基因参与了多种生物学过程和信号通路。其中，丝裂原活化蛋白激酶10(MAPK10)位于基因共表达网络的中心。敲除MAPK10可抑制炎症、纤维化、电紊乱和细胞凋亡，显著减弱心房结构重构和电重构，从而降低db/db小鼠对房颤的敏感性。
大连医科大学附属第一医院夏云龙教授团队发表了题为“Time series RNA-seq analysis identifies MAPK10 as a critical gene in diabetes mellitus-induced atrial fibrillation in mice”的文章。通过时间序列RNA-seq分析db/db小鼠T2DM模型心房的基因表达谱，验证中枢基因MAPK10的作用，发现敲除MAPK10可抑制炎症、纤维化、电紊乱和细胞凋亡，显著减弱心房结构重构和电重构，从而降低db/db小鼠对房颤的敏感性。 其中，英国MappingLab公司的高分辨荧光标测技术在心电重构研究中发挥了重要作用。


方法：
房颤诱导、高分辨荧光标测、超声心动图、组织学、RNA-seq、RT-PCR、WB、注射重组腺相关病毒、标记法
结果展示：
1. db/db小鼠心房结构和电重构以年龄依赖的方式增加
本实验研究了db/db小鼠的结构和电重构特点、确定了糖尿病对心房结构重塑的影响。程序刺激显示，随着db/db小鼠（图1A)日龄的增加，房颤的发生率和持续时间均增加。超声心动图、H&E染色、Masson三色染色均显示db/db小鼠左心房宽度（图1b)、炎症细胞浸润程度以及IL-1β和IL-6、I、III型胶原的mRNA表达均呈年龄依赖性增加（图1C、D)。高分辨荧光标测结果显示，在db/db小鼠心房激活代表图中（图1E)，随着年龄的增加，左房的传导时间显著延长；APD在复极过程中呈年龄依赖性延长(APD50，APD70和APD90)，如图所示1F。



图1、db/db小鼠房颤易感性增加及心房结构和电重构的年龄依赖性

2. db/db心房基因表达谱及共表达网络分析结果
文通过对12、14和16周龄左心房组织进行时序RNA-seq分析来确定心房组织中基因表达的变化。通过GO分析确定了具有生物学意义的基因，进一步利用基因共表达网络和基于K-核算法分析了8个显著谱中的81个基因，以确定哪个基因在DM介导的AF中起核心作用。其中MAPK10的表达程度最高（图4A），结果提示MAPK10在AF的调控中起着关键作用。通过qPCR和Western blotting进一步分析MAPK10的表达，并验证其在db/db小鼠（图4B)中的表达增加。 db/db小鼠（图4C)TNF-α的mRNA和蛋白水平也呈增龄性增高。



图4. 用qPCR和Western blotting分析基因共表达网络，并验证核心基因的表达

3.MAPK10基因敲除可减轻糖尿病引起的房颤、炎症、纤维化、电紊乱和细胞凋亡
本研究测试了敲除MAPK10基因是否能降低AF以确定内源性MAPK10的功能作用。病毒注射后4周，rAAV9-SH-MAPK10介导的MAPK10明显降低（图7B)。 注射rAAV9-SH-MAPK10的db/db小鼠组与注射rAAV9-SH-GFP的db/db小鼠组（图5A)相比，糖尿病性房颤的发生率和持续时间明显减少。在注射rAAV9-SH-GFP的db/db小鼠组观察到左心房重构（图5B)，而注射rAAV9-SH-MAPK1的db/db小鼠组的心房扩大明显减轻。此外，在注射rAAV9-SH-MAPK10组的小鼠中（图5C)减少DM引起的心房纤维化，p-p65和TGF-β1水平减低（图5D）。



图5、MAPK10的下调可减轻dm诱导的AF、结构重塑、炎症、纤维化和细胞凋亡

继而评估MAPK10对心房组织中与快速外向K+电流(Ito，f)相关的离子通道蛋白表达的影响。注射rAAV9-SH-GFP 的db/db组，Kv4.3、Kv4.2和K+通道相互作用蛋白2(KCHIP2)的表达水平降低（图6C)。rAAV9-SH-MCAPK10注射组的上述变化明显减轻。



图6. MAPK10下调减弱DM诱导的电重构

实验通过TUNEL检测心脏切片，研究MAPK10下调是否抑制了体内细胞凋亡。在WT小鼠的心脏中很少检测到阳性的心肌细胞。 而db/db小鼠TUNEL阳性心肌细胞明显增多。注射rAAV9-SH-MAPK10的 db/db小鼠，TUNEL阳性心肌细胞数量明显减少（图7A)。Western blot结果表明，注射rAAV9SH-GFP的db/db组小鼠STAT3和Bax蛋白表达上调，促进细胞凋亡，而注射rAAV9-SH-MAPK10的db/db组小鼠STAT3和Bax蛋白表达降低。还观察到注射rAAV9-SH-MAPK10的db/db组小鼠Bax/Bcl-2蛋白表达明显低于注射rAAV9-SH-GFP的db/db组小鼠，提示MAPK10下调抑制细胞凋亡。MAPK10基因敲除通过抑制炎症、纤维化、电紊乱和凋亡来减少结构重构和电重构，从而减轻DM诱导的房颤。



图7、MAPK10的下调通过减轻细胞凋亡、炎症和纤维化来减轻dm诱导的AF

结论：
实验使用RNA-seq分析了db/db小鼠（T2DM模型）中DM介导的与AF发展相关的分子事件。共有2256个基因在不同时间点的DM心房中差异表达。其中MAPK10定位于基因网络的中心，敲除MAPK10通过抑制炎症、纤维化、电紊乱和凋亡，减少结构重构和电重构，从而减轻DM诱发的AF。本研究提示MAPK10是DM相关性房颤的重要调节因子，有可能成为今后防治房颤的靶点。

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