大鼠的基本实验操作技术

汉时光

1.大鼠的绑定
1)徒手固定
右手抓住大鼠尾根部将其轻轻提起，置于笼罩或实验台面上，以左手掌心轻轻扣住大鼠背部，左手拇指与其余四指相对，由耳后抓住大鼠颈背部皮肤，反转手腕使大鼠腹面向上。对较小个体的大鼠也可将拇指和食指插入大鼠腋下环绕，使大鼠头部和肩部置于手掌虎口中，其余三指和掌心握住大鼠身体，反转手腕使大鼠腹面向上。
2)器械固定
根据实验需要可选用器械固定，可用烧杯罩住大鼠身体，将尾部露出，进行尾部操作，或使用大鼠固定器固定。大鼠固定器通常为圆筒形结构，大鼠可自动钻入放在面前的筒状固定器中，通过调节固定器的长短来限制钻进筒中大鼠的活动，主要用于尾部操作。
3)解剖板固定
麻醉后的大鼠可固定于专用解剖板上，按实验所需体位，用纱布条或细棉绳绑定四肢，另外一头可以固定于板周边缘上，必要时可令大鼠腹面向上，用皮筋扣住门齿，以固定头部。
4)注意事项
大鼠切齿较长，抓取不当、刺痛或激怒状况下可能咬伤实验者，应注意个人防护。抓住尾部提取大鼠时，如果抓住靠尾端部，若大鼠挣扎激烈可导致鼠尾皮肤撕脱。徒手抓取大鼠时，如果握力太大可使大鼠窒息死亡，应在操作时不断有意识地调整和放松力量。
2.供试品给予方法
1)经口途径
(1)口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让大鼠自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，以及复制某些与食物有关的人类疾病动物模型。
(2)灌胃法：在急性实验中，宜采用灌胃法。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成，大鼠的灌胃针长6～8cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小金属圆球，金属球是中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端可弯曲成20°左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。用左手固定大鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从大鼠的口腔插入，压迫其头部，使口腔与食道成一直线，将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力，此时可略微变换灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势推进直至所需深度，推出少许药液并观察动物反应，如动物表现安静、呼吸正常，可缓慢推入余下药液，然后轻轻退出针头。一般灌胃针插入大鼠食道为4～6cm。大鼠灌胃量一般是1ml/100g，常用灌胃量一般每次可为1～4ml。
2)经皮肤途径
大鼠是常用的经皮给药模型，尤其是用于经皮毒性试验。首先对大鼠背部一定面积的皮肤脱毛，以前用脱毛剂，现在常用不损伤皮肤的直流电电动剃刀。大鼠脱毛后用专用的固定架固定，将药液涂在皮肤上，用透气材料覆盖并以无刺激胶布固定一定时间(如4h)，将大鼠从固定架取出，去除胶布和覆盖物，用温水清洗，吸干身上的水珠。使用挥发性的药液必须在通风橱内进行。
3)注射途径
皮下注射：一般选取背部皮下及后肢皮下。注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，把针尖轻轻向左右摆动，容易摆动则表明已刺入皮下，然后注射药物。给药容量为0.1～0.3ml/10g体重。
(1)皮内注射：参见小鼠的方法(第十章)执行。
(2)肌内注射：肌内注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位。注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。注射部位宜选大腿外侧肌群。
(3)静脉注射：大鼠的静脉注射常采用尾静脉注射。参见小鼠的方法(第十章)。一次的注射量为0.1～0.2ml/10g体重。
(4)腹腔注射：参见小鼠的方法(第十章)执行。
4)其他途径给药方法
(1)呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸汽或雾等状态的药物或毒气，可通过动物呼吸道给药。如实验时给动物做乙醚吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用较广泛。
(2)脑内给药：常用于微生物学动物实验，将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。用手掌压住大鼠身体，并固定头部，在前额正中的眼耳连线中点，垂直进针，刺入2～3mm，一次注射的参考量为0.03～0.05ml。
(3)直肠内给药：使用顶端光滑膨大的针头(或灌胃针)，用手指按摩法排出大鼠直肠内的粪便，徒手固定大鼠，使大鼠保持头低尾高，妥善固定其尾部后，将针头慢慢插入大鼠肛门，并顺直肠方向推进，达到所需深度后推进药液，同时使针头缓慢退出至药液完全注入。
3.样品收集
1)血液采集
(1)尾静脉采血：需血量较少时，如作红、白细胞计数，血红蛋白测定，制作血涂片等可用此法。动物麻醉后，用75％乙醇消毒尾部皮肤，用刀割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出。采血结束后，消毒、止血。多次反复采血应从尾尖部开始。
(2)眼眶后静脉丛采血：采用一根特制的长7～10cm的硬质玻璃取血管，其一端内径为1～1.5mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可。将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用。采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，眼眶后静脉丛充血。右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，刺入4～5mm深，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中。采血结束后，拔出取血管，放松左手，无菌纱布按压止血。用本方法大鼠一次可采血0.5～1.0ml。
(3)股静脉或股动脉采血：大鼠多采用股静脉或股动脉采血，方法是：大鼠经麻醉后，剪开腹股沟处皮肤，即可看到股静脉，把此静脉剪断或用注射器采血即可，股动脉较深需先剥离，再采血。
(4)腹主动脉采血：大鼠麻醉后，仰卧于实验台上，剖开腹腔，移开腹部脏器，暴露位于后腹壁的腹主动脉，以注射器向心方向刺入抽取血液。此法常用于实验结束时，采血量较大。
2)尿液及粪便采集
(1)代谢笼法：将大鼠放在特制的代谢笼内，动物排便时，可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开，达到采集的目的。由于大鼠尿量较少，操作中的损失和蒸发，大鼠膀胱排空不一致等，都可造成误差，因此一般需收集5h以上的尿液，最后取平均值。如需要测定尿中活性成分，尿液收集瓶应置于冰袋中，或采用可以制冷的代谢笼。
(2)反射排尿法：大鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故若需采取少量尿液时，可提起大鼠，将排出的尿液接到带刻度的容器内。用手指轻轻按摩大鼠直肠两侧，也可刺激大鼠反射性排出粪便。
3)精液采集
(1)电刺激采精法：主要器材为大鼠固定板、电极、电源。将雄性大鼠呈站位或卧位保定，剪去包皮周围的被毛，并用生理盐水冲洗、拭干，将电极插入直肠直至到靠近输精管壶腹部的直肠底壁(深度2～3cm)。选择电极电源的频率、电压和电流至大鼠勃起射精，收集精液(电刺激参数：频率20～30Hz，电压3～12V，电流4～12mA，1～3s/次，间隔时间2～5s)。
(2)附睾内采精法：参见小鼠的方法(第十章)执行。
(3)阴道栓涂片法：参见小鼠的方法(第十章)执行。
4.麻醉与镇痛
1)吸入麻醉法
麻醉药以蒸汽或气体状态经呼吸道吸入而产生麻醉，常用乙醚作为麻醉药。使用乙醚麻醉大鼠时，可将动物放入有机玻璃麻醉箱内，把装有浸润乙醚棉球的小烧杯放入麻醉箱，然后观察动物。开始动物自主活动，不久动物出现异常兴奋，不停地挣扎，随后排出大、小便，渐渐由兴奋转为抑制，倒下不动，呼吸变慢。如动物四肢紧张度明显减低、角膜反射迟钝、皮肤痛觉消失，则表示动物已进入麻醉，可行手术和其他操作。乙醚易燃，应避免引火，并应在通风橱中进行麻醉。
2)注射麻醉法
常用的麻醉药有戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙酯等。大鼠常采用腹腔注射法进行全身麻醉。封闭群大鼠对麻醉药的反应个体差异较大，在注射麻醉药物时，先用麻醉药总量的2/3，密切观察动物生命体征的变化，如已达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑制延脑呼吸中枢，导致动物死亡。
大鼠腹腔注射全身麻醉常用药物及用量如下。戊巴比妥钠：3％～5％生理盐水溶液，腹腔注射40～50mg/kg体重。硫喷妥钠：1％～3％水溶液，腹腔注射40mg/kg体重。氨基甲酸乙酯(乌拉坦)：20％～25％水溶液，腹腔注射1000～2000mg/kg体重。氯胺酮：腹腔注射75～90mg/kg体重。
3)局部麻醉
用局部麻醉药阻滞周围神经末梢或神经干、神经节、神经丛的冲动传导，起到局部性麻醉与镇痛作用。局部麻醉操作方法很多，可分为表面麻醉、局部浸润麻醉、区域阻滞麻醉及神经干(丛)阻滞麻醉。
(1)表面麻醉：利用局部麻醉药的组织穿透作用，透过黏膜，阻滞表面的神经末梢。在口腔及鼻腔黏膜、眼结膜、尿道等部位手术时，可把麻醉药涂敷、滴入、喷于表面上，或尿道灌注给药。药物宜选用0.5％～1％利多卡因。
(2)区域阻滞麻醉：在手术区四周和底部多点注射麻醉药阻断疼痛的向心传导。常用药为0.5％～1％普鲁卡因。
(3)神经干(丛)阻滞麻醉：在神经干(丛)的周围注射麻醉药，阻滞其传导，使其所支配的区域无疼痛。常用药为0.5％～1％利多卡因。
(4)局部浸润麻醉：沿手术切口逐层注射麻醉药，靠药液的张力弥散浸入组织，麻醉感觉神经末梢。常用药为0.25％～0.5％利多卡因、0.5％～1％普鲁卡因。
5.安死术
1)颈椎脱臼法
将大鼠置于粗糙平面上，左手拇指与食指用力向下按住鼠头的同时，右手抓住鼠尾用力向后拉，将脊髓与脑髓拉断，大鼠立即死亡。此法适用于体重200g以下的大鼠。
2)急性失血法
大鼠麻醉后，可采用股动脉放血方法使大鼠急性失血死亡。
3)过量麻醉法
注射过量麻醉药物，以常用麻醉剂量的10～20倍注射造成动物死亡。也可以吸入过量的乙醚、异氟烷、异氟醚、甲氧氟烷等麻醉药使动物致死。
4)CO2致死法
将大鼠放入专用的容器或塑料袋内，打开CO2储气罐，通过气体输送管，将CO2输入容器内，大鼠吸入CO2后逐渐昏睡，直至死亡。CO2价廉、不易燃、不易爆、不对环境产生污染，当装置选用合理时，对操作人员也没有任何危害。现在有商品化的CO2动物处死设备。

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