中耳炎动物模型

余纪永

中耳炎动物模型【动物造模】
中耳炎(otitis media with effusion,OME)主要分为化脓性(suppurative)中耳炎和分泌性(secretory)中耳炎两种。在抗生素未全面发展的时代，儿童化脓性OME的发病率很高，常导致鼓膜穿孔、中耳乳突炎及颅内、外并发症，造成严重的传导性耳聋或神经性耳聋，严重时可导致儿童死亡。分泌性 OME在儿童中发病率高，是引起小儿听力下降的常见原因之一。咽鼓管功能障碍，其原因包括：腺样体肥大、鼻腔和鼻咽部疾病、腭裂、咽鼓管上皮内表面活性物质缺乏或不足、咽鼓管的清洁和防御功能障碍。病毒及衣原体和支原体的感染和免疫反应等。随着抗生素的发展，中耳感染的发病率明显下降，但咽鼓管功能差，可导致自发性OME。
【造模机制】近年来的研究证明，中耳并非免疫豁免部位，在外来抗原激发下可产生较强的局部免疫反应。无论是中耳注射细菌、内毒素或其他抗原物质或是手术造成耳咽管功能障碍等OME动物模型，中耳黏膜的急性化脓性炎症感染导致咽鼓管咽口及管腔黏膜出现充血、肿胀，纤毛运动发生障碍，致病菌乘虚侵入中耳，引起OME。常见的致病菌主要是肺炎球菌、流感嗜血杆菌等。而细菌的分解产物内毒素，导致中耳黏膜的炎症反应及中耳腔渗出。其基本表现为：致病物质导致中耳黏膜处炎性细胞浸润，早期见杯状细胞纤毛上皮部分消失，杯状细胞明显增生。而细菌死亡时释放的活性物质——内毒素，它的主要成分为脂多糖，能引起中耳黏膜结缔组织增生。细胞密度增大，毛细血管通透性增高，腺体及杯状细胞的分泌增加，破坏正常黏膜运转系统，促进中耳积液的蓄积，使中性粒细胞募集，大量的黏液细胞增生与化生。内毒素还可经过经典途径及替补途径激活补体，使嗜碱性粒细胞或肥大细胞释放组胺、5-羟色胺、激肽和其他血管活性介质作用于靶细胞，从而引起血管扩张，毛细血管通透性增加，同时趋化因子能吸引白细胞向炎性病灶部位聚集，促进吞噬。在发挥吞噬作用的过程中，释放溶酶体酶等生物活性物质，除破坏抗原性异物外，同时也可损伤邻近组织和加剧炎症。严重OME中耳结构发生病理改变，造成传导性听力损失。细菌或炎症物质循裂隙或两窗浸润或扩散进入内耳导致内耳出现病理改变，造成感音神经性听力损失。
细胞因子的免疫调节：细胞因子是一组在炎症反应和免疫反应中起重要调节作用的糖蛋白，具有多种生物活性。许多研究表明在OME发病中有细胞因子的参与。研究发现OME患者中耳积液存在 IL-21、IL-22、IL-26、TNF等，并提示IL-218及IL-26与慢性OME早期阶段有关，而TNF则与疾病的持续状态密切相关。研究还发现OME早期中耳积液的形成与IL-28高表达直接相关。OME中耳积液中存在TGF2β，推测TGF2β在慢性OME并发症(如胶耳、粘连性OME等纤维化)行程中发挥关键作用。另外，机体免疫防御机制缺陷可能是OME发病的又一环节，发现OME患儿血清中存在一些免疫抑制因子，与对照组相比，免疫抑制因子影响T细胞增殖，这些抑制因子对OME持续状态的形成起一定作用。
通过小鼠OME模型证实，NO是产生中耳积液的重要介质，其认为慢性OME黏蛋白分泌是NO介导的脂多糖(LPS)与多种细胞因子相互作用的结果。另外，细胞因子(如TNF、IL-28等)与NO相互作用发挥免疫调节作用，TNF2α增加NO的形成，IL-28则通过抑制NO合酶而减少NO的生成，当NO合成减少时，免疫防御作用减弱，影响OME转归。
长期以来，腺样体(adenoids)被认为是OME发病的重要因素，但其致病机制尚未完全明确。目前，认为腺样体引起OME主要有以下观点：①增生肥大的腺样体压迫、阻塞咽鼓管，造成鼓室负压而致黏膜渗液。②增大的腺样体阻塞后鼻孔，导致吞咽时鼻咽部压力升高，致使咽部分泌物向咽鼓管反流进入中耳。③腺样体是细菌的“储蓄池”。目前已从中耳积液中发现多种细菌、病毒和支原体等病原体，同时从OME患儿的鼻咽部和腺样体组织中也培养出类似的病原菌。腺样体切除治疗OME的有效机制可能是通过减少腺样体在鼻咽部的细菌池作用。④腺样体免疫异常。有认为腺样体的免疫功能异常使鼻咽部黏膜易感染和水肿，这种炎症和水肿又导致咽鼓管功能紊乱而引起OME。
【造模方法】尽管目前OME的动物模型种类繁多，也的确模拟出了OME的临床特征，但这种阻塞咽鼓管或直接向中耳腔注入灭活细菌、细胞因子、变应原等的造模方法终究不是OME的实际发病途径，因此，建立更符合0ME实际发病过程的动物模型仍将是今后研究的重要课题。
1．利用灭活细菌诱导OME模型方法是于1980年建立的，一直沿用至今。所用细菌多为肺炎链球菌或流感嗜血杆菌，与临床中耳积液中检出的细菌种类一致。造模前先用水浴加热法或甲醛灭活法灭活细菌并制备成一定浓度的细菌混悬液，造模时依动物种类、大小不同注入不同量(0.1～0.5ml)的灭活细菌混悬液于中耳腔。注入方法有经鼓膜前下象限穿刺注入法和经听泡钻孔注入法(注入后用骨蜡封闭钻孔)。两种注入法各有优缺点，经鼓膜穿刺法简单、方便，但因穿刺后造成的鼓膜穿孔和鼓膜炎症反应会影响中耳积液的蓄积和对鼓膜颜色的观察；经听泡钻孔注入法保持了鼓膜的完整性，但需手术暴露听泡，对动物创伤大，且易感染。采用经豚鼠鼓膜穿刺注入水浴加热灭活的肺炎链球菌，造模成功率为71％；采用经栗鼠听泡钻孔注入甲醛灭活的流感菌，造模成功率为100％。
2．小鼠免疫反应分泌性OME动物模型制作动物给予1.2mg卵清蛋白溶于0.6ml磷酸盐缓冲液(PBS)，以5.14mg氢氧化铝为免疫佐剂行腹腔注射，每周1次，连续2周，此为全身致敏阶段；2周后，麻醉小鼠，无菌将15μl卵清蛋白经鼓膜前下方注入鼓室，24小时后小鼠再次麻醉，观察鼓膜，并重复注射第2次，此为耳内激发阶段，造成分泌性中耳炎模型。
3．大鼠分泌性OME动物模型建立  选健康大鼠，手术暴露听泡。听泡内注入330μl浓度为1mg/ml的脂多糖(LPS)，或者听泡内注入纤维蛋白封闭剂(fibrin sealant)后再注入30μl浓度为1mg/ml LPS。制作大鼠的OME模型时，使用听泡内先注入纤维蛋白封闭剂再注入LPS的方法较单纯听泡内注入LPS的方法成功率高，OME的病程迁延时间长。
【模型特点】OME是以中耳积液、听力下降为主要特征的非化脓性炎症，因此，无论采用何种方法造模，成功的OME动物模型必须具备如下特征：①中耳出现积液；②积液培养无活的病原微生物；③鼓室压力改变和(或)ABR反应阈提高；④中耳组织出现非化脓性炎症病理改变。常用的评判指标：①耳镜检查：观察鼓膜颜色(如变暗、呈淡黄色、棕红色、琥珀色等)、形状(内陷、膨隆)及活动度的改变；②声导抗检查鼓室图呈平坦型(B型)或低峰型，鼓室负压(C型)/脑干诱发电位引不出，阈值升高或波峰分化不良。
【模型评估和应用】主要看OME症状出现的类型和程度，评估的指标主要是：鼓膜改变(颜色、光锥、活动和薄厚)；中耳压力、鼓室积液、鼓室黏膜改变(增生、水肿和炎症渗出)，以及听骨链的活动度；内耳改变主要是炎症浸润入耳蜗，导致感音神经性听力损失。

文章转载于北京吉田生物科技有限公司

青瓷器

湘岚

介是神马？！！

茫茫人生路

打酱油的人拉，回复下赚取积分

大羚羊

边撸边过

兴博

支持你哈...................................

风之遇

珍爱生命，果断回帖。

潮流服饰

……

峰雨无阻

报告！别开枪，我就是路过来看看的。。。

猫公子

楼下的接上