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耳（Ear）是哺乳动物的听觉器官，也是识别方位维持身体平衡的器官，耳主要由外耳、中耳和内耳三部分组成。外耳负责声音搜集，中耳负责声音放大，内耳充满淋巴液，当接受中耳传来的声波撞击后，会造成淋巴液的流动，内耳中的毛细胞可把液体波动变换成神经信号，进而由内耳耳蜗神经传送至听觉中枢，最终实现听觉。
耳结构（图片来源：World Report On Hearing）
世卫组织公布的《世界听力报告》指出，现有超15亿人患有不同程度的听力损失，到2050年，患听力损失的人数将近25亿，是常见的神经感觉障碍疾病之一。据统计，大约50%的先天性听力损失与遗传因素有关，目前临床上的治疗方案主要为佩戴助听器或植入人工耳蜗，但此类方法没有从根本上治愈听力损伤。随着基因治疗的蓬勃发展，基于病毒载体的基因疗法成为治疗遗传性听力损失的新热门赛道。
重组腺相关病毒载体（recombinant Adeno-associated virus, rAAV）具有血清型种类多样、免疫原性低、长期稳定表达基因、宿主范围广等优势，在基因功能研究和基因治疗递送载体中占据主导地位。
内耳系统在完成听觉过程中发挥重要作用，完整的听觉讯息由内耳细胞所转换而成，内耳的耳蜗神经又会将这些讯息传送至听中枢神经。因此借助AAV载体高效感染内耳细胞治疗遗传性听力损失，具有很好的应用前景。
内耳结构（PMID: 32708116）
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AAV血清型的选择
内耳包含三种主要功能细胞：毛细胞（Hair Cells, HCs，包括内毛细胞, Inner hair cells, IHCs和外毛细胞, Outer hair cells, OHCs）、支持细胞（Sertoli Cells, SCs）和螺旋神经节（Spiral Ganglion Neurons, SGNs）。AAV血清型种类多样，AAV1、AAV2、AAV6、AAV8、AAVDJ等血清型过去被报道可以感染IHCs，但对于OHCs和SCs的感染效率低，甚至是不感染。
Anc80L65被报道可以高效感染小鼠耳蜗毛细胞，其中对于IHCs的转导效率接近100%，但对于幼年和成年鼠的OHCs转导效率差异过大，且对于SCs的感染率较低。AAV-PHP.B和AAV-PHP.eB能够跨血脑屏障，研究发现AAV-PHP.eB亦可以高效感染耳蜗毛细胞和螺旋神经节。且AAV-PHP.B对于非人灵长类的HCs有较高的转染率。此外，在内耳的基因治疗中，AAV2.7m8同样表现出可以高效感染HCs，且能高效感染内柱细胞（inner pillar cells, IPCs，支持细胞的一种）和内脂细胞（inner phalangeal cells, IPhC，支持细胞的一种），但对于其他支持细胞的感染效率较低。
不同AAV血清型对于HCs的感染效率（PMID: 30683875）
和元生物可提供AAV1-9、Anc80L65、AAV-PHP.eB和AAV2.7m8等几十种AAV血清型病毒包装服务。
在AAV-DJ的基础上筛选优化的AAV-ie可以高效转导HCs，同时可以更高效感染多种类型SCs。此外，AAV-ie携带Atoh1（耳蜗毛细胞再生因子）感染内耳后，实现了内毛细胞再生。
AAV-IE对于SCs感染（PMID: 31427575）
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注射方式与注射剂量
针对内耳细胞的感染，常采用圆窗膜注射（round window membrane, RWM）或后半规管注射（Post semicircular canal, PSCC）。
| 注射方式 | AAV注射体积 | AAV注射剂量 | | RWM | 幼年小鼠：0.5~1.5 μL成年小鼠：~2 μL | 幼年小鼠：0.5~1E+10vg成年小鼠：2~5E+10vg | | PSCC | 成年小鼠：~1 μL | 成年小鼠：~2E+10vg |
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应用案例
2022年2月，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院舒易来主任、李华伟教授与中国农业科学院（深圳）农业基因组研究所左二伟研究员等团队合作在Cell Research期刊在线发表题为“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究论文。该研究以AAV-PHP.eB和AAV9作为高效的基因治疗递送载体，转染听觉内毛细胞，首次实现基于CRISPR/Cas9-HMEJ技术治疗隐性遗传性感音神经性聋成功的研究，为遗传性耳聋的精准治疗以及临床转化提供了强有力的科学证据。（阅读原文：Cell Res | 舒易来/李华伟/左二伟团队开发CRISPR/Cas9-HMEJ系统取得遗传性聋基因治疗新突破）
设计HMEJ同源重组治疗方案。a 针对筛选的sgRNA，设计HMEJ同源臂。b 基于AAV作为体内递送载体的双AAV治疗体系，其中一个AAV递送用于表达Cas9的载体，另外一个递送表达sgRNA以及携带同源臂的载体。（PMID: 35197607）
| 病毒产品 | AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor | | 实验动物 | P1 Klhl18lowf鼠 | | 注射方式 | RWM | | 感染部位 | 耳蜗 | | 病毒用量 | 共0.5μL |
2019年钟桂生课题组与合作者以AAV-ie作为高效的基因治疗递送载体，携带Atoh1（耳蜗毛细胞再生因子）感染内耳后，实现了内毛细胞再生。
AAV-ie-Atoh1诱导内毛细胞再生（PMID: 31427575）
| 病毒产品 | AAV-ie-Atoh1-NLS-mNeonGreen | | 实验动物 | P0小鼠 | | 注射方式 | RWM | | 感染部位 | 耳蜗 | | 病毒用量 | 1E+10vg | | 检测时间 | 14天 |
参考文献
[1] World Report On Hearing
[2] PMID: 32708116
[3] PMID: 28165475
[4] PMID: 30581889
[5] PMID: 30683875
[6] PMID: 31427575
[7] PMID: 33268240
[8] PMID: 32387678
[9] PMID: 35197607
和元生物（股票代码：688238）成立于2013年，是一家聚焦基因治疗领域的生物科技公司，专注于为基因治疗的基础研究提供基因治疗载体研制、基因功能研究等CRO服务;为基因治疗药物，包括重组病毒载体药物、溶瘤病毒、CAR-T细胞治疗产品等的研发提供工艺开发及测试、IND-CMC药学研究、临床样品GMP生产等CDMO服务。以"赋能基因治疗，共守生命健康"为使命，以基因治疗载体研发、生产为核心，公司将坚持以客户为中心、以提供专业服务为己任，打造国际领先的基因和细胞治疗CXO集团企业，加快基因治疗的基础研究、药物发现、药学研究、临床和商业化进程，推动基因治疗行业发展，造福人类健康！ |
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发表于 2022-11-28 14:38:44
